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科研成果

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朱平课题组发现可高效催化合成紫杉醇前体的新糖基水解酶

 

天然药物活性物质与功能国家重点实验室朱平研究员领导的研究团队近日在国际蛋白质组研究顶级杂志Molecular & Cellular Proteomics (MCP) (http://www.mcponline.org/content/early/recent)在线发表了题为:Cloning and characterization of the glycoside hydrolases that remove xylosyl group from 7-β-xylosyl-10-deacetyltaxol and its analogues”doi:10.1074/mcp.M113.030619的研究论文。MCP是蛋白质组研究领域影响因子最高的杂志,近5年综合影响因子为8.633,2012年公布的影响因子为7.398。
研究人员根据活性跟踪从伞菌香菇中分离到序列未知的糖基水解酶蛋白,在确证其具有7-木糖-紫杉烷糖基水解酶活性、且为b-木糖苷酶/b-葡萄糖苷酶双功能酶后,以生物信息学为指导,采取蛋白质LC-MS/MS“从头测序”(de novo sequencing)与RT-PCR/RACE技术相结合的策略,挖掘并获得了编码该酶的基因(cDNA及其结构基因)。Blast分析结果表明,该基因序列与NCBI,JGI等数据库中现有序列一致性(Identity)极低;其酶蛋白的氨基酸序列只与数据库中已注册的一些假定蛋白序列较为接近(一致性43-59%), 因而可以确定为全新的糖基水解酶(国际专利申请号: PCT/CN2011/072678; 国际专利公布号: WO2011/160484 A1)。该基因在毕赤酵母宿主中获得高效表达,重组酶具备与天然酶一致的酶活性。进而对重组酶进行了较为系统地表征。更为重要地是:在优化条件下,24小时内工程酵母细胞可以高效催化7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇为半合成紫杉醇的前体—10-去乙酰基紫杉醇(在10位乙酰化即为紫杉醇),在底物投料量过饱和(10 g/L)时,转化率仍然高达85%左右,最高产量达8.42 g/L。
 
 
紫杉醇(paclitaxel, Taxol®)是一个具有确切抗癌疗效的二萜化合物,其结构新颖,作用机制独特,在细胞分裂过程中,它促进微管聚合,抑制微管解聚,从而抑制细胞分裂,发挥其抗肿瘤作用。自199212月被美国FDA批准上市以来,一直是销售额最大的抗肿瘤药物。据统计,紫杉醇及其相关产品的年销售额在2011年已突破45亿美元。同时,紫杉醇在临床应用范围在不断扩大,成功用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤、大肠癌、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤等十几种实体瘤。美国FDA2007年还批准紫杉醇用于治疗类风湿性关节炎并可作为心脏支架涂层。因此,随着应用范围的扩大和新剂型等的应用,市场上对紫杉醇的需求量也将越来越大。直接从野生红豆杉的树皮等部位提取紫杉醇的方法,因给红豆杉野生资源带来毁灭性的破坏而早已被我国明令禁止,目前主要通过苗圃栽培从红豆杉枝叶中提取紫杉醇。然而,紫杉醇在红豆杉中的天然含量十分低微(~0.02%),但红豆杉中7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量却十分丰富,最高可达紫杉醇含量的几十倍(可高达 0.5%),作为紫杉醇提取时的副产物,既污染环境又造成红豆杉资源的极大浪费。
上述研究结果为深入开展这类糖基水解酶结构与功能关系研究、尤其是其专一性水解脱除7-木糖紫杉烷木糖基的作用机制的研究奠定了基础;在提高红豆杉资源利用率和变废为宝、减轻因提取紫杉醇时废弃物的排放而对于环境的污染,以及增加紫杉醇的临床供应量等方面也有着广阔的应用前景。
 
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